a cura di Alessandra Crisà (CREA)

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Una recente normativa europea (Reg. UE n. 56/2013) ha reintrodotto l’uso di proteine animali trasformate (PAT) da non ruminante nell’alimentazione dei pesci d’acquacoltura. Un’attenzione specifica è richiesta nel controllo della qualità dei mangimi e delle materie prime per questo settore. Il progetto SUSHIN ha previsto, fra le diverse attività che lo caratterizzano, una serie di studi per approfondire questo aspetto.

L’approccio genetico per la rilevazione di DNA di ruminante in farine di pollo

Questo studio ha previsto nella sua prima fase le prove di estrazione di DNA da 3 tipologie di ingredienti in uso comunemente dalle aziende di mangimi per l’acquacoltura (forniti dalla Nutreco N.V., azienda mangimistica che produce specialità zootecniche, premiscele e servizi nutrizionali all’industria dell’alimentazione animale). I campioni analizzati sono stati: a) farina di pollo esente da contaminazione da ruminanti b) siero di latte liofilizzato c) farina di ruminante.

Sulla base dei risultati di questa prima fase, incentrata sull’estrazione del DNA da campioni di farine animali e derivati del latte si procederà all’uso di un approccio genetico quantitativo, la real-time PCR, per la verificare sia la sua efficacia che la sensibilità nel quantificare tracce di DNA di mammifero in campioni di farina avicola. Quale fonte di contaminazione di DNA di ruminanti verrà utilizzata la farina di “ciccioli di bovino” e siero di latte liofilizzato.

Per le tre tipologie di campioni sono state utilizzate quantità crescenti di materiale di partenza (da 25 a 500 mg). Per verificare la presenza quanti/qualitativa di acidi nucleici nei campioni in esame sono stati applicati quattro protocolli di estrazione con kit della ditta Promega®.

Il primo kit prevede un’estrazione classica con tamponi di lisi, di precipitazione e di lavaggio previ passaggi in centrifuga da banco.

Il secondo kit prevede, oltre ai suddetti passaggi, l’uso di colonnine specifiche per il legame e la successiva eluizione di DNA.

Il terzo e quarto kit prevedono l’impiego di cartucce specifiche per l’estrattore automatico Maxwell 16^TM (Promega) e diversi metodi di pre-trattmento del campione. Il quarto kit è stato provato solo sul siero di latte liofilizzato.

In tutte le prove è stato inserito un trattamento enzimatico per l’eliminazione dell’RNA dai campioni.

I campioni sono stati sottoposti a controlli quali/quantitativi mediante lettura spettrofotometrica e elettroforesi in gel di agarosio 1%.

RISULTATI

1. Per quanto riguarda le quantità di materiale di partenza è stato ottenuto DNA di buona qualità e quantità sufficiente a partire da 25 mg di farina di pollo o ruminante.
2. Nel caso del siero di latte, con i protocolli utilizzati, non sono state ottenute quantità di DNA confrontabili con quelle delle farine, ma molto inferiori, per quantità e qualità, al limite di rilevamento, sia in gel di agarosio che in spettrofotometria.
3. Tra i kit testati è stato selezionato quello che ha ottenuto le rese migliori sia per quantità che per qualità del DNA estratto. 

 a cura di Maria Miarelli (CREA)

Una recente normativa europea (Reg. UE n. 56/2013) ha reintrodotto l’uso di proteine animali trasformate (PAT) da non ruminante nell’alimentazione dei pesci d’acquacoltura. Un’attenzione specifica è richiesta nel controllo della qualità dei mangimi e delle materie prime per questo settore. Il progetto SUSHIN ha previsto, fra le diverse attività che lo caratterizzano, una serie di studi per approfondire questo aspetto.

L’analisi microscopica per il controllo di contaminazioni di ossa di mammifero in farine di pollo

Le attività svolte hanno riguardato:

1. la verifica della presenza di eventuale contaminazione da farina di mammifero in campioni di farina di pollo;
2. la stima quantitativa dell’incidenza di ossa di mammifero in campioni caratterizzati da un diverso rapporto di farina avicola e farina di ruminante.

Per le prove analitiche è stato adottato il metodo microscopico di cui di cui alla direttiva 2003/7126/CE della commissione del 23 dicembre 2003 che stabilisce il metodo analitico per la determinazione dei costituenti di origine animale nell’ambito del controllo ufficiale degli alimenti (Fig. 1).

Il metodo consente di individuare farine animali nei mangimi, di identificare la classe zoologica di appartenenza (mammifero, avicolo, pesce) e di stimare la percentuale di tessuto osseo.
Le farine animali di diversa classe zoologica di provenienza sono accomunate dalla presenza di elementi organici aspecifici, quali fibre muscolari, gelatina, sangue. Tuttavia tali farine possono distinguersi per elementi organici caratteristici della classe di appartenenza (peli per i mammiferi, piume per i polli, scaglie per i pesci).
A fronte di ciò l’elemento chiave nell’analisi microscopica è però costituito dai frammenti di ossa (frazione inorganica), che, per la loro struttura istologica altamente specifica, consentono di identificare la classe zoologica di appartenenza (Fig. 2).
I frammenti di ossa, inoltre, consentono di effettuare una stima quantitativa della loro presenza, da cui è possibile risalire, qualora si conosca la quota organica percentuale della tipologia di prodotto in analisi, alla stima totale della farina animale presente nel prodotto.

1. Analisi microscopica delle farine animali (proteine animali trasformate – PAT)

Lo studio ha preso in considerazione 5 farine di residui di macello avicolo di diversa provenienza, caratterizzate da una diversa incidenza di scarti di pollo e tacchino. Per ogni farina, un campione di 10g è stato introdotto in un imbuto separatore con circa 200 ml di tetracloroetilene, per separare la frazione organica dalla frazione inorganica. La frazione inorganica (più pesante) è stata raccolta in una capsula, quella organica è stata ottenuta previa filtrazione. La frazione inorganica è stata essiccata, pesata e setacciata ottenendo due frazioni granulometriche (>0,5 e <0,5mm).
Ogni singolo frammento di ossa della frazione >0,5 è stato pesato con l’approssimazione di 1 10^-5g, schiacciato, aggiunto di una soluzione di acqua e glicerina ed osservato al microscopio ottico.
Inoltre sono stati allestiti diversi preparati della frazione <0,5 ed esaminati al microscopio ottico, contando i frammenti presenti in ciascun campo ottico esaminato, al fine di valutare la percentuale delle particelle di ossa estranee al prodotto eventualmente presenti.
Sono stati allestiti alcuni preparati della frazione organica, al fine di rilevare la presenza di elementi estranei al prodotto in esame.

In ciascuno dei 5 prodotti esaminati non è stato riscontrato alcun elemento riconducibile alla presenza di farine di mammifero.

2. Analisi quantitativa di frammenti di ossa di mammifero in farina di pollo negativa per PAT di ruminante

Lo scopo dello studio era quello di verificare l’efficacia e la sensibilità dell’esame microscopico nel quantificare tracce di farina di mammifero in campioni di farina avicola. Quale fonte di contaminazione di frammenti di osso di ruminanti è stata utilizzata la farina di “ciccioli di bovino” che all’esame microscopico è risultata contenere una frazione ossea dello 0,6 %.  La PAT avicola presentava invece il 14,0 % di frazione inorganica (ossa).
Conoscendo quindi le rispettive quote di materiale organico ed inorganico (ossa) delle due farine di partenza, è stata preparata in laboratorio una miscela delle due farine con una percentuale nota di ossa di mammifero (0,1 %). Tale limite coincide con il valore di sensibilità del metodo indicato nella normativa (Dir. 2003/7126/CE) ed è stato deciso inoltre sulla base dell’esperienza decennale dai laboratori del Centro di Zootecnia e Acquacoltura del CREA, che hanno effettuato le analisi di revisione dei prodotti zootecnici contestati in prima istanza per la presenza di farine animali nell’ambito dei controlli BSE.
Il campione così costituito in laboratorio è stato sottoposto ad analisi microscopica seguendo il protocollo descritto precedentemente, quindi analizzando tutta la frazione inorganica (ossa >0,5 e <0,5) per la ricerca e rispettiva quantificazione di frammenti ossei delle due classi in esame.

A fronte di una preparazione del campione di analisi contenente 0,1% di ossa di mammifero, la stima quantitativa della presenza di ossa di mammifero è stata di 0,166 % a dimostrazione dell’idoneità dell’applicazione del metodo microscopico di stima quantitativa anche per le indagini su matrici esclusivamente di origine animale come le PAT.

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