Tuttavia, questi approcci da soli potrebbero non essere sufficienti per comprendere esaustivamente l’effetto del mangime sul metabolismo dei pesci, sul loro stato e sulla reale performance complessiva dei mangimi.
L'analisi chimica convenzionale ci fornisce infatti solo una composizione grossolana dei principali macronutrienti, sovente abbinata ad un'analisi di specifiche classi di composti molecolari di interesse, quali ad esempio gli acidi grassi e gli amminoacidi. Non è in grado tuttavia di fornire informazioni più precise su composti chimici nella loro forma nativa, né sui metaboliti più piccoli ma egualmente importanti sia dal punto di vista nutrizionale che antinutrizionale1.
Le recenti metodiche analitiche cosiddette “omiche” consentono una nuova visione olistica dei sistemi biologici. Tra queste, La Metabolomica si concentra sulla rilevazione di piccole molecole (peso molecolare <1500 Da), che sono appunto i prodotti metabolici (metaboliti) di un dato sistema biologico, sia esso cellule, tessuti o organismi complessi2. Il profilo metabolico di un organismo rappresenta una fotografia (o meglio un'impronta digitale) del suo stato metabolico nel momento in cui si esegue il campionamento. I metaboliti appartengono a diverse classi di composti come acidi organici, carboidrati, amminoacidi o piccoli peptidi, acidi grassi liberi o esterificati in forma di mono-, di-, trigliceridi o fosfolipidi, nucleosidi e nucleotidi, steroidi e derivati steroidei, terpenoidi, carotenoidi o flavonoidi. Spesso la Metabolomica è in grado di fornire semplici risposte a problemi molto complessi, come appunto è l'articolato susseguirsi di reazioni biochimiche di un organismo vivente in seguito ad un qualsiasi evento esterno, come una variazione della dieta, uno stress termico, una patologia, etc. (si veda ad esempio ref 14).
L'ottimizzazione di opportuni protocolli di preparativa assume un ruolo chiave nelle indagini Metabolomiche. Il campionamento deve essere eseguito evitando le cause di stress nel pesce, la selezione dei tessuti da analizzare deve essere ben definita in base agli obiettivi dello studio, il processamento del campione prevede specifici trattamenti termici che prevedono l'uso dell'azoto liquido, il trasporto refrigerato in ghiaccio secco, la polverizzazione in azoto liquido, lo scongelamento in opportuni solventi e seguendo dosi e tempistiche ben definite, il trattamento degli estratti deve essere anch'esso ottimizzato rispetto al fine ultimo del lavoro. Tuttavia, i protocolli di preparativa sono spesso rapidi. Per questo, gli studi di Metabolomica prevedono il coinvolgimento di personale altamente specializzato e laboratori dotati di strumentazione all'avanguardia.

 

La rilevazione dei metaboliti può avvenire attraverso due principali modalità, l’impronta digitale molecolare (fingerprinting metabolico) o il profilo molecolare (profiling metabolico): la prima si basa sull'analisi non identificativa e simultanea di tutti i metaboliti presenti nel sistema in esame (o meglio in gruppi di sistemi), allo scopo di caratterizzare associazioni o differenze fra i gruppi di profili composizionali osservati; la seconda si basa sull'identificazione e/o quantificazione non selettiva (untargeted) o selettiva (targeted) dei metaboliti.
L’acquisizione dei dati metabolomici avviene attraverso piattaforme analitiche caratterizzate da un alto rendimento in termini di velocità e riproducibilità, quali la Spettroscopia di Massa e la Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), consentendo di acquisire in breve tempo un numero ampio e rappresentativo di campioni 3. L’elaborazione e l’analisi statistica della conseguente grande mole di dati sperimentali grezzi vengono effettuate tramite degli algoritmi bioinformatici dedicati, mentre per la loro interpretazione biologica vengono realizzati dei database molecolari specifici, in grado di estrapolare le informazioni specifiche sulle vie metaboliche interessate e sulle funzioni di uno o più metaboliti.
Numerosi studi realizzati mediante approccio metabolomico hanno contribuito ad accrescere la comprensione dei meccanismi molecolari associati non solo alle problematiche nel settore della nutrizione e della qualità del prodotto ittico, ma anche nel monitoraggio della salute e del benessere dei pesci e nella valutazione dell'impatto ambientale sui medesimi 4,5,6.
Variazioni del profilo lipidico e polare nei filetti di pesce, nel fegato o nel siero indotte dalla somministrazione di diversi mangimi o all’effetto di altri fattori quali stress, temperatura o stagionalità possono quindi essere rapidamente caratterizzate con approcci di tipo metabolomico 7,8,9,10.
Tali approcci si sono dimostrati efficaci, ad esempio, per discriminare diverse specie ittiche selvatiche da quella di allevamento, nonché di discriminare i pesci allevati in base alle origini geografiche attraverso l’impronta molecolare lipidica e/o polare del filetto 11,12,13. Altre importanti applicazioni hanno consentito di caratterizzare l'effetto metabolico della bassa temperatura dell'acqua in orata, una specie notoriamente sensibile al freddo.
I metaboliti individuati come importanti per la discriminazione dei pesci in termini di differenti profili metabolici acquisiti nel filetto, nel sangue o nel fegato sono indicati come biomarcatori di modificazioni metaboliche. Ad esempio, metaboliti come la colina, la TMAO e il glicerolo sono stati correlati al processo di trasporto e compartimentalizzazione degli acidi grassi nell’organismo dei pesci 15,16. Altri metaboliti come il glucosio, il lattato e la creatina sono stati individuati come indicativi di un metabolismo energetico dei pesci alterato da condizioni di carenza di cibo o di digiuno 17,18. Infine, i livelli di alcuni metaboliti individuati nel fegato dei pesci come la glicina, la serina e la treonina sono stati identificati come biomarcatori molecolari in conseguenza di sostituzioni della farina di pesce con farine vegetali 8,19 .
L'obiettivo finale del progetto AGER 4F consiste nell'ottimizzare diete specifiche per le specie allevate di maggior valore commerciale, quali orata, branzino e trota, in modo tale che abbiano il minore impatto metabolico sul pesce stesso. I primi risultati ottenuti sono molto promettenti in questo senso.
In conclusione, l’approccio innovativo di tipo metabolomico contribuisce grandemente alle conoscenze di base sviluppate con il progetto AGER 4F, consentendo di testare l'impatto metabolico delle formulazioni mangimistiche caratterizzate da parziale o totale sostituzione della farina di pesce.
Roberto Anedda e Riccardo Melis, Porto Conte Ricerche Srl.